◆產品概要

　　本試劑盒是可以定性分析細胞培養上清和體液樣品中提取的細胞外囊泡，以及定量分析si氨酸（PS）特異性結合的蛋白在固定化的板上與細胞外囊泡反應并固定后，用任意細胞外囊泡表面標記蛋白的小鼠單抗作為檢測一抗，試劑盒中的HRP標記抗小鼠IgG抗體為二抗，可高靈敏度檢測表面具有任意標記蛋白的細胞外囊泡。

◆特點

采用PS結合分子Tim4包被板，可高靈敏度定性·定量檢測培養上清中的細胞外囊泡

●　通過磷脂酰si氨酸（PS）結合分子進行捕獲。^※1

●　可檢測出0.1 μL左右培養上清液的細胞外囊泡。

●　可用純化細胞外囊泡標準品^※2 定量檢測。

●　高靈敏度檢測（檢測靈敏度可達WB^※3 的50～1,000倍）。

使用優化的試劑組成的試劑盒，操作簡便，實驗重復性高

●　優化對照用的一抗^※4

●　優化檢測用的二抗^※5

●　采用顯色法

※1 本方法比起使用抗體包被板的ELISA法，可以更好地定性·定量分析細胞外囊泡。

※2 請使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS純化的細胞外囊泡標準品。

※3 WB法：免疫印跡實驗

※4 配套抗人CD63抗體。檢測其他表面標記蛋白可使用任意小鼠單抗。

※5 配套抗小鼠IgG抗體-HRP標記。

◆試劑盒組成

◆應用實例

從各種細胞培養上清提取細胞外囊泡的定性分析

　　將1 ng從各種細胞培養上清中提取的細胞外囊泡添加至孔中，使用能識別表面標記蛋白CD9、CD63、CD81的一抗通過本試劑盒對各表面標記量進行定性比較。

　　另外，作為比較參考數據，將150 ng從各細胞培養上清提取的細胞外囊泡進行電泳，使用能識別表面標記的CD9、CD63、CD81的一抗對各表面標記蛋白量以Western blotting進行定性分析。

提取外泌體（1 ng/well）的定性比較數據                            　　　　　　　參考比較數據

在ELISA系統和WB分析之間，標記蛋白的表達模式具有相關性。

參考數據：各種細胞的外泌體標記蛋白表達分析

分別使用1 ng各種細胞的培養上清液來源純化外泌體（使用MagCapture來源外泌體提取試劑盒 PS），外泌體標記蛋白CD9、CD63、CD81對應的抗體，進行表達分析。

檢測抗體

<ELISA>

抗CD9小鼠單抗（M-L13）

抗CD63小鼠單抗（H5C6）

<WB>

抗CD9兔多抗

抗CD63小鼠單抗（8A12）

抗CD81小鼠單抗（1D6）

細胞株不同，表達量wan全不同！

有的細胞株中可能存在對特定標記蛋白的表達較少的外泌體。

從正常人血清中提取的細胞外囊泡的定性分析

　　從正常人血清的6個樣品分別提取細胞外囊泡，通過BCA法算出細胞外囊泡膜上的蛋白濃度。分別添加40、20、10 ng的細胞外囊泡到孔中，用可識別表面標記CD63的對照組檢測一抗（試劑盒配套）對檢測的OD值進行定性比較。

提取外泌體（1 ng/well）的定性比較數據

即使是從體液樣品中純化的細胞外囊泡也具有良好的線性

從細胞培養上清中提取的細胞外囊泡的檢測靈敏度的參考數據

　　從COLO201細胞培養上清中提取細胞外囊泡，比較本試劑盒和免疫印跡的檢測靈敏度。

Western blot和ELISA的檢測靈敏度比較

圖（a），（b）為使用各種抗CD63抗體（其他公司產品，FUJIFILM Wako產品： 012-27063）進行免疫印跡的檢測靈敏度數據

樣品：COLO201細胞培養上清提取細胞外囊泡（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS提取）

★：各抗體中免疫印跡的檢測上限。

圖（c）Exosome ELISA Kit檢測上限數據

　　使用本試劑盒梯度稀釋COLO201細胞來源的純化細胞外囊泡（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS）后的樣品以及僅有緩沖液的空白值檢測并制備COLO201標準曲線。利用此標準曲線可算出COLO201來源純化樣品的zui低檢測靈敏度。（按照各濃度點n=6，空白點n=12檢測）

相比免疫印跡，可以更高靈敏度地檢測標記蛋白。

從細胞培養上清中提取細胞外囊泡的稀釋線性（Linearity）參考數據

　　用從COLOC201細胞培養上清中提取的細胞外囊泡作為標準品制作標準曲線，評價COLO201細胞培養上清樣品的5個稀釋度（1：100-1：1600）的線性。

COLO201細胞培養上清

　　標準品：COLO201細胞來源外泌體

　　（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS純化）

　　檢測樣品：COLO201細胞培養上清

　　一抗：試劑盒配套抗CD63抗體

可以確認到良好的稀釋線性以及可檢測出0.1 μL細胞外囊泡。  

檢測不同接種細胞數和不同培養時間的培養基中的細胞外囊泡

　　在T75細胞培養瓶中接種1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷的COLO201細胞，培養72 h。每24 h回收一部分的培養上清樣品，用PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD）和試劑盒配套的Control Primary Antibody Anti CD63 (100×) 進行CD63的吸光度檢測。

　　準備4 μL的細胞培養上清，用添加了Exosome Binding Enhancer的反應液/清洗液（1×）稀釋至100 μL。

● 檢測樣品：COLO201細胞培養上清（25倍稀釋）

● 接種細胞數：1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷個細胞/瓶

● 培養時間：24 h、48 h、72 h

● 一抗：抗CD63抗體

　　只需使用4 μL的細胞培養上清液，就可直接檢測細胞外囊泡量，在討論新型的細胞株的培養條件時，省去了討論條件的時間。

　　可以簡單方便地討論如何分泌最多的細胞外囊泡的條件。

添加藥物后引起細胞外囊泡數量的變化

　　在T225培養瓶接種K562細胞，以無血清培養基培養72 h。之后更換添加終濃度為10 μmol/L的莫能菌素鈉和不含莫能菌素鈉的無血清培養基，再培養24 h。培養后回收培養上清樣品，用PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD）和試劑盒配套Control Primary Antibody Anti CD63（100×），檢測CD63的吸光度。

　　用添加了Exosome Binding Enhancer的反應液/清洗液（1×）稀釋回收后的細胞培養上清，分別作為10倍稀釋和100倍稀釋的細胞培養上清樣品。

● 檢測樣品：K562細胞培養上清（更換含莫能菌素鈉（產品編號：ALX-380-026-G001）的培養基和對照培養基后培養24 h）

● 一抗：抗CD63抗體

　　無需提取，少量培養基即可檢測。

　　可檢測培養基中外泌體量隨時間的變化，由于可數值化外泌體變化量，因此相比WB法更容易進行比較。

使用COLO201細胞培養上清來源和人血清來源純化外泌體比較檢測靈敏度

　　制備下列①~⑥的樣品，比較用PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒、A公司ELISA試劑盒、A公司ELISA試劑盒（高靈敏型）檢測外泌體標記蛋白CD63時的靈敏度。

使用樣品內容

① A公司ELISA試劑盒配套標準品

② A公司ELISA試劑盒（高靈敏型）配套標準品

③ 用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS提取COLO201細胞培養上清來源外泌體

④ 用聚合物沉淀法提取COLO201細胞培養上清來源外泌體

⑤ MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS提取人血清來源外泌體

⑥ 聚合物沉淀法提取人血清來源外泌體

　　PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒相比A公司ELISA試劑盒和A公司ELISA試劑盒（高靈敏型），可更靈敏地檢測到CD63。另外，A公司ELISA試劑盒和A公司ELISA試劑盒（高靈敏型）對各自試劑盒配套標準品的反應敏感，但對PS提取外泌體的反應性弱。

　　由此證明，PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒相比公司ELISA試劑盒和A公司ELISA試劑盒（高靈敏型），可以更高特異性且高靈敏性地檢測外泌體表面的CD63。